Абстракт: Несмотря на существенный прогресс, достигнутый в лечении многих заболеваний за последние 70 лет, некоторые подходы и методы остались почти неизменными. Так, основой тромболитической терапии с момента открытия фермента стрептокиназы является активация профермента плазминогена и перевод его в плазмин, который разрушает фибриновые нити тромба. Фактически, тромболитики активируют фибринолитические возможности организма. Существенным недостатком такого метода терапии является отсутствие специфичности в активации плазминогена, что приводит к его активации по всему организму с последующими серьезными побочными геморрагическими эффектами, включающими внутренние кровотечения, а также аллергические реакции, рвоту, снижение артериального давления и т.д. Важным ограничением является и узкое терапевтическое окно, которое составляет максимум 3-5 часов с момента проявления симптомов тромбоэмболии. Таким образом, применение тромболитиков сильно ограничено и должно учитывать многочисленные риски. Немаловажным является и крайне высокая стоимость данных препаратов.
Целью данного проекта является разработка комплексного подхода в создании высокоселективного лекарственного средства для тромболизиса, основанного на применении непосредственно плазмина, энтрапированного в альбуминовую матрицу. Плазмин является идеальным кандидатом для таргетной доставки по нескольким причинам. Традиционные тромболитики нуждаются в образование плазминоген-фибринового комплекса для активации плазминогена, однако данный комплекс существует только несколько часов после возникновения тромба. Это обуславливает узкое терапевтическое окно существующих тромболитических препаратов. Необходимость сначала в формировании плазминоген-фибринового комплекса, а затем активации плазминогена замедляет наступления терапевтического эффекта; на каждом из этапов как активатор плазминогена, так и плазмин могут быть ингибированы. Адресно доставленный плазмин оказывает прямое воздействие на фибрин в тромбе вне зависимости от времени его образования, а создаваемая локально высокая концентрация в месте образования тромба нивелирует действие ингибиторов и ускоряет тромболизис. Предлагаемый нами метод энтрапирования плазмина для таргетной доставки будет разработан впервые. Энтрапирование, в отличие от инкапсулирования, представляет собой полную иммобилизацию плазмина внутри протеиновой матрицы и его защиту от действия ингибиторов плазмина с сохранением ферментативной активности.
Конкретными задачами проекта являются: (1) разработка протоколов синтеза альбуминовых наночастиц с контролируемыми параметрами размера и структуры; (2) разработка способов энтрапирования плазмина в протеиновую и керамическую матрицы; (3) функционализация поверхности наночастиц таргетными молекулами (антителами к специфичным участкам фибрина); (4) разработка методик применения полученных конъюгатов на моделях тромбов, а также на тромбах ex vivo; (5) оценка биосовместимости и цитотоксичности полученных наночастиц на моделях животных клеток.
Результаты: 1) Впервые были получены сложносоставные протеиновые наноконтейнеры с инкорпорированными магнетитовыми наночастицами, стабилизированные оболочкой полиэтиленгликоля, и обладающие способностью контролируемо высвобождать малые молекулы. На основе данных наноконтейнеров впервые был создан прототип гемостатического таргетного препарата с аминокапроновой кислотой.
2) Были созданы и протестированы тромболитические наночастицы на основе плазмин нагруженных наночастиц карбоната кальция (ватерита) с инкорпорированными наночастицами магнетита. Подход по таргетной доставке плазмина пористыми наночастицами описан впервые. Эффективность данных наночастиц не уступает чистому плазмину и в некоторых аспектах выигрывает за счет особенностей носителя (локальное повышение pH до оптимальных значений и увеличение локальной концентрации плазмина с дополнительной пенетрацией тромба).
3) Были синтезированы оболочки диоксида кремния, загруженные урокиназой, полученные темплатным путем за счет вытравливания матрицы карбоната кальция. Данный метод позволил получить простую систему с постепенным релизом белка, которая показала себя эффективнее, чем только урокиназа и обеспечивала более равномерный и пролонгированный лизис модельных тромбов. В рамках работы также были продолжены исследования протеиновых наноконтейнеров и установлена сложная природа их образования в зависимости от загруженного вещества. Было установлено, что незначительные концентрации протеаз могут значительно ускорять релиз из таких контейнеров. Также было изучено поведение наноразмерных частиц ватерита с размерами меньше 300 нм. Было установлено, что при таком размере система становится крайне нестабильной и подвержена крайне быстрой перекристаллизации, что снижает её терапевтические возможности.
