Биокерамические материалы пролонгированного действия для профилактики и терапии атеротромбоза

 

Абстракт: Атеротромбоз является причиной более 28% случаев смерти в мире. Частота его постоянно увеличивается, в пользу чего свидетельствует резкий рост заболеваемости инфарктом и инсультом. Парадокс ситуации заключается в том, что несмотря на свою чрезвычайную социальную значимость, до сих пор нехирургические способы терапии данных заболеваний развиты очень слабо. Традиционные тромболитические ферменты очень быстро теряют свою активность при введении в организм человека и инактивируются. Увеличение дозы приводит к дополнительным геморрагическим осложнениям. Вместе с тем, комплексность проблемы заключается в разработке способов борьбы не только с признаками тромбоза, но и его первопричиной – атеросклерозом. Мультидисциплинарный и международный коллектив участников проекта за последнее время развил новую концепцию по созданию лекарственных биокерамических материалов пригодных для внутривенного/внутримышечного введения в организм человека. Подход заключается в том, что в пористую наноструктурированную матрицу (обычно на основе бемита или магнетита – единственных оксидов одобренных FDA для парентерального введения) особым образом помещается терапевтический фермент. При этом с одной стороны фермент остается доступным для внешней среды, не теряет своей нативной структуры и способен оказывать свою терапевтическую функцию, а с другой – оказывается полностью блокированным внутри матрицы, маскируя свое присутствие от иммунной системы. Такой подход позволяет не только создавать лекарственные средства пролонгированного и направленного (благодаря магнитным свойствам магнетитовых наночастиц) действия, но и сильно стабилизировать чувствительные молекулы белков. Несмотря на существенный научный задел группы, в рамках данного проекта мы впервые делаем упор на создание биокерамических материалов для терапии атеротромбоза. Научная новизна проекта связана с тем, что предлагается создать биосовместимый протеолитический материал пролонгированного и направленного действия, где наночастицы и ферменты неразрывно связаны друг с другом.  Проект предусматривает фундаментальные междисциплинарные исследования в области коллоидной химии, энзимологии, фармакологии и медицины, с учетом чего и подобран состав команды. В качестве основных результатов проекта планируется получение коллоидных жидкостей, состоящих из атеротромболитических наночастиц. Данные системы будут подвергнуты тщательному физико-химическому анализу и испытаниям in vitro, описывающим их поведение в организме человека, механизм активации и инактивации, метаболизма. Будут сделаны выводы о взаимосвязи структуры биокомпозита и его свойств. На заключительном этапе планируются испытания на послеоперационных биоматериалах: тромбах и атеросклеротических бляшках. По итогам реализации заявляемого проекта будет разработана платформа и новейшая концепция создания наноструктурированных лекарственных препаратов пролонгированного действия для терапии атеротромбоза.

 

Результаты: 1. Впервые осуществлен ультразвук-ассистируемый синтез стабильного гидрозоля магнетита при нейтральных значениях pH и без использования стабилизирующих добавок и пептизаторов. 
2. Полученные гидрозоли были использованы для энтрапирования широкого спектра высокомолекулярных соединений. Исследование механизмов активации данных систем показало, что несмотря на полную локализацию активных молекул в объеме ксерогелей они способны проявлять свою каталитическую функцию, существенно возрастающую с ростом температуры. Многие энтрапированные ферменты показывают рост каталитической активности вплоть до температур при которых нативные формы денатурируют в растворе, полностью теряя свою первоначальную активность. Результаты подкреплены фундаментальными квантово-химическими расчетами. 
3.Впервые получены керамические тромболитические материалы на основе магнетита и бемита. В качестве тромболитических ферментов исследовались как фибрин-специфичные активаторы плазминогена урокиназного типа, так  и неспецифичная стрептокиназа. Исследована поведенческая модель взаимодействия энтрапированных форм ферментов с высокомолекулярным плазминогеном. Объяснен механизм активации фибринолизиса. 
4. Тромболитические материалы были получены как форме тонких керамических покрытий для сосудистых имплантатов, так и в форме стабильных наноколлоидов для инъекций. Показано, что эффективность магнитотромболитической терапии может превышать несколько тысяч раз по сравнению с обычными ферментами. 
5. Впервые описан способ получения магнетитового геля прямым гелеобразованием гидрозоля магнетита, что позволило осуществить получение наносфер, прибегая к использованию метода микроэмульсий. Гелеобразование происходит под влиянием депротонирующего агента и приводит к образованию плотного и сильномагнитного геля. Полученный гидрогель состоит из 10 нм магнетитовых наночастиц, связанных межчастичными связями Fe-O-Fe, и демонстрирует высокую степень биосовместимости в соответствии с исследованием цитотоксичности, проведенным на клеточных линиях HeLa и MSC. Наносферы магнетита содержащие тканевый активатор плазминогена в дальнейшем подвергались испытанию на тромболизис. Процесс тромболизиса начинался по истечении 30 минут после контакта компонентов, активизируя взаимодействие плазмина с фибрином. Вместе с подходом, подразумевающим использование микроэмульсий, был разработан новый метод получения магнитных наносфер, получаемых за счет контролируемой дестабилизации устойчивого гидрозоля магнетита, приводящий к образованию агрегатов различного размера с последующей их стабилизацией цитратной оболочкой. Полученные агрегаты проявляют быстрый магнитный отклик и обладают низкой цитотоксичностью (проверенной на клеточных линиях Hela), что открывает широкие перспективы разработанных систем в медицине. 
6. Проведены работы по созданию магнитных золь-гель композитов на основе каркасной матрицы магнетита и ферментов, обладающих протеазной и гидролазной активностью. В качестве ферментов были выбраны коллагеназа, трипсин и папаин. Помимо ферментативного лизиса бляшек, рассматривался вопрос о возможном применении фотосенсибилизаторов, позволяющих генерировать активные формы кислорода при облучении светом, что приводит к гибели и лизису клеток, подвергнутых воздействию. Для создания магнитоуправляемых фотосенсибилизаторов были выбраны два вещества: применяемый в клинической практике хлорин Е6 и его полусинтетическое производное борфторхлорин. По результатам исследований был также разработан протокол инкубирования фрагментов атеросклеротических бляшек. Разработанная методика позволяет сохранять структуру и состав атеросклеротических бляшек в течение как минимум 21 дня после операции. Для исследования антиатеросклеротической активности к постоперационным бляшкам добавляли коллоидный раствор, содержащий 1 % масс. наночастиц магнетита с энтрапированным фотосенсибилизатором хлорин Е6, после чего проводили облучение лазером с длинной волны 630 нм и мощностью 50 мВт. Измеренная токсичность свободного фотосенсибилизатора оказалась примерно в 2 раза выше, чем для иммобилизированной формы, однако, будучи сконцентрированным при помощи магнитного поля гибридный препарат демонстрирует цитотоксичность близкую к свободному фотосенсибилизатору. Исследование изменений структуры атеросклеротической бляшки выполнялось путем воздействия на них иммобилизированного фотосенсибилизатора с последующим гистологическим исследованием тонких срезов биоткани. Исследование структуры срезов атеросклеротических бляшек показало, что фрагмент подверженный воздействию фотодеструкции демонстрирует более рыхлую структуру, которую можно отнести к следствию токсического воздействия на клетки гладкой мускулатуры в структуре бляшки. 
7. Получен магнитоуправляемый гемостатический препарат на основе тромбина. Энтрапирование тромбина в магнетитовую золь-гель матрицу было осуществлено методом контролируемой соконденсации с наночастицами магнетита. Полученные данные свидетельствуют о том, что время до гемостаза на системе с наведенными магнитным полем наночастицами оказалось в несколько раз меньше по сравнению с контролем. Еще более выдающиеся данные были получены при измерении массы потерянной крови: в 15.5 раз меньше по сравнению с контролем при соответствующем содержании фибриногена в крови.  По результатам эксперимента показано, что гемостатический коллоид сам по себе способствует ускорению процесса гемостаза, но при этом не вызывает системной коагуляции крови. Вместе с тем, его локализация за счет наложения внешнего магнитного поля приводит к усилению гемостатической активности в требуемой области, что само по себе открывает новые горизонты для малоинвазивной гемостатической терапии.
8. Представлен универсальный метод по ренатурации ферментов. Подход основан на использовании высокозаряженных наночастиц, которые после электростатического взаимодействия с денатурированными молекулами белка, предотвращают их агрегацию и делают процесс рефолдинга контролируемым и управляемым. Метод показал высокую эффективность, способность ренатурировать сразу несколько ферментов in situ затратив минимальный промежуток времени и количество реактивов. 
9. Получены принципиально новые тромболитические магнитные наноконтейнеры с возможностью точного контроля размера. Синтез наноконтейнеров включал в себя три стадии: образование стабильной микроэмульсии, гелеобразование гидрозоля магнетита и промывка получаемых сфер. Образованные сферы обладали хорошо развитой пористой структурой с высокой удельной площадью поверхностью. В качестве тромболитических ферментов изучали прямой активатор плазминогена урокиназного типа и непрямой активатор стрептокиназного типа. При формировании наносфер в присутствии ферментов они надежно удерживались в объеме материала. Биосовместимость полученных материалов была исследована на клеточных линиях HeLa и мезенхимальных стволовых клетках, в результате было показано, что концентрации до 260 мкг/мл являются малотоксичными. Цитотоксичность не превышала таковую для наночастиц магнетита, что говорит о высокой биосовместимости синтезированных гибридных систем. Предварительная оценка ферментативной активности гибридных композитов проводилась при помощи колориметрических тестов по измерению уровня активного плазмина с использованием хромогенного субстрата. Было установлено, что препарат на основе стрептокиназы, как в тестах на специфическую активность, так и в случае с реакцией на хромогенный субстрат, оказался малоактивен, и не вызывал разрушения модельных сгустков даже через 24 часа инкубирования. Для исследования активности наносфер с урокиназой, были приготовлены искусственные тромбы из цельной человеческой крови. Без магнитного нацеливания, тромболитический композит оказался в 11 раз менее эффективным по сравнению с эквивалентным количеством свободного фермента, однако при наложении внешнего магнитного поля происходило увеличение скорости разложения тромба в среднем на 430% вследствие повышения локальной концентрации действующего вещества. При этом профиль кинетической кривой лизиса свидетельствовал о том, что инкапсулированный фермент обладал намного большей стабильностью в присутствии ингибиторов, что говорит о повышении стабильности урокиназы в составе наноконтейнеров и возможности создания на их основе тромболитических препаратов пролонгированного действия.
10. Создан тромболитический препарат, состоящий исключительно из биосовместимых компонентов: тромболитического препарата урокиназы, адсорбированной на магнитные наночастицы, покрытые гепарином (ГП) в качестве кросслинкера. Главным отличием от ранее описанного метода по созданию тромболитических наноконтейнеров является упрощенный способ синтеза. С помощью созданных магнитных носителей удалось увеличить эффективность действия урокиназы как минимум в 20 раз в терминах скорости времени растворения тромба. Адсорбция урокиназы на магнетит проводилась посредством промежуточного линкера – гепарина. Гепарин увеличивает гидрофильность поверхности магнетита, биосовместим, а также проявляет антикоагулянтные свойства. В нашей композиции нам удалось добиться такого сочетания гепарина и урокиназы, при котором гепарин не проявляет своих ингибирующих свойств. Факт ингибирования урокиназы гепарином малоизвестен, но тем не менее, имеет место быть. Это важный факт, который в данный момент не учитывается при совместном использовании антикоагулянтов и урокиназы в клинической практике. Проведенный эксперимент по изучению влияния магнитного нацеливания показал, что скорость растворения тромба при накладывании магнитного поля возрастает минимум в 2 раза. Снижение площади тромба на 60% достигалось за 35 минут с использованием только УК, за 12минут с использованием МГ@УК и 7 минут с использованием МГ@УК и наложением магнитного поля. Препарат также не вызывает присущих тромболитикам геморрагических осложнений и отличается широтой терапевтических доз.